斑马鱼基因编辑技术服务

项目介绍

 

百维斯生物具有多年斑马鱼基因编辑技术经验，提供全流程目的基因编辑服务，包括从同源基因分析到基因拯救的各个步骤。利用斑马鱼的优势，及公司专业的基因编辑技术，可快速构建斑马鱼各基因编辑模型，基因敲降及过表达项目缩短至一个月，斑马鱼敲除、tol2转基因制备、定点定向模型构建可在5至6个月内实现，大大缩短基因编辑实验周期。

 

 

斑马鱼的优势

 

ž   斑马鱼体积小，幼鱼体长只有 1–3mm，可使用96孔微孔板进行高通量全自动化分析

ž   成本低，占地空间小（100 平米空间可养殖 30000 只成鱼）

ž   药物用量少（微克级），仅为鼠类实验的1/100至1/1000

ž   体外发育，极易获得用于生物医学研究和药物实验的动物样本

ž   产卵量大，每只雌鱼每周产卵可达 300–500 枚，全年周而复始

ž   发育迅速，受精后24h主要器官已建成，受精后2–5天，类似于人体的主要器官均已工作，如心脏，脑，血液，血管，胰腺，肝脏等

ž   身体透明，受精后前 7 天内部器官清晰可见，有节律心跳和血液循环

ž   实验周期短，大部分实验能够在 1–2 周内完成，而传统体内实验通常需要 1 个月以上

ž   斑马鱼和人类的疾病信号转导通路高度保守，斑马鱼与人类同源基因比例高达 87%，某些疾病相关基因与人类基因保守性高达 99%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体。

 

 










服务内容：

 

1. 基因敲降：为观察目的基因的敲降对早期胚胎发育的影响，利用创新的 CRISPR/CasRx knockdown 技术，瞬时破坏基因的编码序列，从而降低基因的表达水平来研究基因的功能，用于各个阶段的基因功能研究。

2. 基因过表达：为观察目的基因的过表达对早期胚胎发育的影响，通过构建目的基因过表达载体，体外转录合成相应的mRNA, 将mRNA  以不同剂量注射到早期胚胎中，即可研究目的基因过表达对胚胎发育及组织器官形成的影响。

3. 斑马鱼基因敲除：针对靶基因序列设计guide RNA, 指导Cas9 蛋白在特定基因位点引起DNA双链断裂，在体内修复断裂DNA的过程中，靶点附近产生碱基随机插入或缺失突变，最终导致目的基因功能缺失，从而达到基因敲除的目的。

4. 斑马鱼转基因品系构建：将外源基因随机整合到斑马鱼基因组中，在已知的启动子信息下可用于标记特定器官和细胞、指示特定基因的表达模式、调节特定基因的表达及功能水平等。

5. 斑马鱼定点突变构建服务：定点插入外源核酸片段，用于标记基因的精准表达模式，构建点突变，实现时间空间上控制基因表达等。

 

 

技术原理:

 









CRISPR/CasRx knockdown 技术原理











 

基因敲除技术原理













 

转基因技术原理

 

 

服务流程

 

 










 


 

案例展示

 

1、体内验证某基因对血管生成有促进作用，采用血管荧光斑马鱼品系(VEGFR2:GFP)胚胎进行敲降实验，可见斑马鱼节间血管数量显著少于对照组，从而验证该基因对血管的功能作用。













2、验证CRISPR/CasRx 对外源报告基因EGFP的剪切效果，可见CRISPR/CasRx 能高效剪切外源报告基因EGFP。
























3、混合系白血病1 (MLL1)基因在早期胚胎发育和造血中起着至关重要的作用。 MLL-AF9融合基因是染色体易位所致，常导致急性髓系白血病，预后差在较差。

研究者在斑马鱼胚胎中过表达人MLL-AF9融合基因相应mRNA，发现其过表达导致了斑马鱼的造血功能异常。

部分结果如下：

(a) Western Blot结果表明，与对照组相比，过表达时胚胎中MLL蛋白含量显著增加；

(b) 定量PCR结果显示，MLL下游基因表达量显著上升；

(c-e) 整体原位杂交分析MLL下游基因表达变化；

(f-h) 过表达MLL-AF9 mRNA时，髓系细胞标记基因l-plastin, mpy和lyz表达量增加。

 






























 

常见问题

 

1、基因敲除的 sgRNA 如何设计？

sgRNA 的设计需要遵循以下原则：

1）不影响其他基因，尤其是编码蛋白的基因。

2）尽可能影响所有的转录本，敲除位点最好在编码区的前 50%，但避免敲除 ATG 所在外显子或 ATG 之 前的外显子。

3）片段敲除的 sgRNA 设计在内含子上，这样能敲除整个外显子区，避免翻译出残留蛋白。

4）在设计 sgRNA 时要综合考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC 含量、潜在的脱靶位点等信息。例如靶点的 GC%尽量不要低于 40%，靶点序列 GC%偏高（50%~70%）有较高的打靶效率；靶点内不 要有连续 4 个以上的 T 碱基，避免形成 RNA Pol III 的转录终止信号等。

2、斑马鱼胚胎显微注射实验操作方法

斑马鱼显微注射是将实验材料直接注射到1-4细胞期的斑马鱼胚胎中，由于在这个胚胎发育早期没有膜分隔细胞和卵黄，注入1个细胞或卵黄的溶液将扩散到整个胚胎中。通过注射不同类型的实验样品，实现基因的瞬时过表达、表达敲降、以及制备转基因或突变斑马鱼品系等研究。

3、显微注射的注意事项

显微注射的操作过程中有许多细节影响实验的成功率，主要包括以下几方面。

1）注射样品的质量和和浓度。

2）注射前小心将显微注射针定位，注射针定位到卵表面的注射角度是穿透坚硬的卵壳注射成功的关键。

3）破针时，将针尖一点点剪断，不宜一次剪太多。

4）注射时注射器的压力不宜变化太快，否则会造成注射量操作难以控制，导致胚胎内环境改变过快过大甚至胀破细胞。氮气罐的压力阀显示气体的压力，压力为0表明罐内无气体，需要及时换气。

5）注射完毕，慢慢抽出注射针，避免受精卵内物质随着毛细针抽出，造成受精卵的损伤。