导读
一种新型的基于 Trmt5 缺陷引发的具有自发性炎症性肠病样表型的斑马鱼模型
炎症性肠病 (IBD) 是一种以胃肠道慢性炎症为特征的复杂综合征，研究者使用 CRISPR-Cas9 方法，基于 tRNA 甲基转移酶 5 ( trmt5 ) 基因生成了能够存活的trmt5 -/-斑马鱼作为一种新型斑马鱼 IBD 模型。
通过对trmt5 -/-斑马鱼与野生型斑马鱼（WT）进行对比发现：trmt5−/−的肠上皮减少，肠皱襞结构消失，上皮扁平，细胞核定位紊乱，杯状细胞减少（图1a和图1b）；肠上皮细胞中观察到微绒毛被破坏和缩短，肠上皮细胞 (IEC) 的紧密连接和粘附连接有缺陷（图1c）中肠中杯状细胞数量减少（图1d）。
吞咽活性测定以及油红O染色测定结果发现：trmt5−/−突变体中右旋糖酐-FITC 在10 dpf (减少60%)和16 dpf (减少90%)时显著减少(图 1e )。16 dpf时trmt5 -/-斑马鱼的前肠区发现了明显的脂质ORO染色信号，表明肠道脂质代谢中断(图1f)。这些数据表明：突变表型主要为后期发育缺陷，反映了trmt5对幼鱼发育后期阶段维持肠道功能的重要性。
a：斑马鱼内脏在 5 dpf、10 dpf 和 16 dpf 时的代表性解剖图；b：在不同时间点对应于两种基因型幼虫的肠球或中肠的矢状切片的代表性苏木精-伊红染色，红色箭头表示中肠中的杯状细胞；c ：16 dpf 时trmt5 -/-和trmt5 +/+肠上皮细胞的 TEM 分析。trmt5 -/- IHC 表现出比野生型对照更短的微绒毛（红色箭头）；d：16 dpf 中肠矢状切面的阿尔新蓝染色；e：在 28.5 °C 下与 1% 葡聚糖-FITC 孵育 4 小时后斑马鱼消化器官的体内成像；f：油红 O (ORO) 染色用于 16 dpf 的中性脂质积累，左图为整片 ORO 染色，右图为冷冻切片。图a-f
应用 RNA 测序分析16 dpf 的trmt5 -/-斑马鱼与野生型斑马鱼，结果显示trmt5 -/-斑马鱼：有 1211 个上调和 3679 个下调的不同表达基因（DEGs）（图 1g)；肠道与 IBD 相关基因的失调（图 1h）。在免疫应答和细菌、病毒感染过程中，上调的DEGs显著富集(图1i）。通过中性粒细胞特异性转基因斑马鱼品系（Tg (mpx: EGFP)），以及qRT-PCR分析巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK)，也证明了trmt5的缺失会导致幼鱼后期肠中中性粒细胞的募集(图1j)。
应用 16s rDNA 扩增测序，结果显示 trmt5 −/−斑马鱼中：肠道微生物多样性显着降低（图1k）；微生物群存在显着差异（图1l）；其肠道微生物组组成在类和科水平上都发生了变化(图1m)。STAMP分析表明：trmt5 -/-突变体在γ-变形菌门中表现出相对丰度增加，而被称为益生菌菌株和抑制炎症的乳杆菌科的相对丰度降低。总之，这些发现表明trmt5 -/-斑马鱼表现出IBD的一些标志性特征，这更可能代表人类克罗恩病。
图g-m
G：差异表达基因 (DEG) 的火山图，红色和蓝色图分别表示上调和下调的 DEG；h ：IBD 相关 DEG热图；i：与trmt5 +/+相比，trmt5−/−中 29 个上调免疫相关基因的圆形热图； j：7 dpf、10 dpf 和 16 dpf的trmt5 −/−和trmt5 +/+ Tg (mpx: EGFP)转基因幼虫的整体装载。Tg (mpx: EGFP)是中性粒细胞特异性转基因系。清晰分散的绿点（由红色箭头表示）代表嗜中性粒细胞，而弥散的绿色信号（由黑色星号表示）是斑马鱼腹腔的背景噪音；k：trmt5 −/−和trmt5 +/+肠道微生物群的阿尔法多样性比较；P：表示显着性 (** p < 0.01, *** p < 0.001)；l ：UniFrac主坐标分析（PCoA）分析：m：trmt5 −/−和trmt5 +/+家族水平的肠道微生物群的宏基因组分析。
在trmt5 -/-突变体的肠上皮细胞中观察到异常和细长的线粒体形态（图 1n），以及COX 和 SDH 的酶活性降低（图1o）。这暗示了trmt5 −/−肠中的 OXPHOS 缺乏。因此导致trmt5 -/-肠中 ATP 的产生减少和 ROS 的过量产生（图 1p，1q）。此外，在trmt5−/−突变体中发现了线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)的激活，线粒体热休克蛋白(Hsp60)在trmt5−/−斑马鱼中显著上调，该蛋白驱动UPRmt，被认为是IBD的重要驱动因素。这些数据表明：trmt5的缺失导致斑马鱼肠道线粒体功能障碍。这可能是自发发展的IBD-like表现型的原因。
图n-r
n： 通过Tg（Xla.Eef1a：MLS-EGFP）转基因幼虫比较trmt5 -/-和trmt5 +/+在16 dpf 的线粒体形态，Tg (Xla.Eef1a: MLS-EGFP)表达线粒体靶向EGFP，细胞核与 DAPI（蓝色）共染色；o：16 dpf 的肠 COX/SDH 染色；p：16 dpf 时的相对总 ATP 产量；q： 16 dpf 时通过 DCFH-DA 染色检查 ROS 的产生；r：参与 UPR mt的蛋白质的表达水平，包括 Hsp60、Afg3l2 和 Lonp1。
作者通过实验还表明，乳杆菌GG (LGG)对trmt5−/−幼鱼有保护作用：缓解了IBD样表型（图1s）；显著降低促炎基因lect2l的表达(图1t), 明显改善吞咽活动 (图1u)，以及延长的中位生存期（图1v）
图s-v
s：实验设计的示意图，两组斑马鱼在 16 dpf 时促炎基因的t mRNA 表达；u： FITC 标记的葡聚糖在16 dpf 处检测到吞咽活动；v：在trmt5 −/−斑马鱼中每天喂食LGG后，存活率显着延长。
结论：本研究在斑马鱼中产生了第一个 Trmt5 缺陷脊椎动物系，该系具有自发发展的人类 IBD 病理特征。进一步的研究表明，通过类似于 IBD 治疗策略能够使该系表型得到部分缓解。因此建议trmt5 -/-斑马鱼可作为研究 IBD 发病机制的疾病模型，以及开发和评估潜在治疗干预措施的平台。
点评：炎症性肠病在斑马鱼上具有传统的研究历史，除了基因缺陷能够引起的相关疾病以外，常见的TNBS等一类药物也能在斑马鱼上诱导相应的模型。斑马鱼丰富的免疫细胞标记品系，以及炎症诱导效应品系（Tg(nfκb:EGFP)）能够为炎症性肠病的发病机理研究提供强有力的支持。
文章作者：浙江大学医学院博士后赵琼和博士研究生常慧为共同第一作者，陈烨教授为论文通讯作者，中国医学科学院赵春华教授和浙江大学生命科学学院邵建忠教授为共同通讯作者。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41392-023-01318-6
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